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Biologia Molecolare
Bibliografia

Descrizione della Malattia

• Fenotipo Clinico

• Citogenetica e Fenotipo Cellulare

• Biologia Molecolare

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Struttura e mutazioni del gene NBS1

La NBS è causata da mutazioni bialleliche (omozigoti o eterozigoti composte) del gene NBS1, localizzato sul braccio lungo del cromosoma 8 (8q21). Il gene è costituito da 16 esoni e si estende per circa 50 kb di DNA. Codifica per una proteina di 754 aminoacidi / 85 kDa denominata nibrina (o p95). 
Tutte le mutazioni causa di malattia oggi note sono state identificate negli esoni 6-10 e tutte tranne una provocano un arresto prematuro della sintesi della catena polipeptidica della nibrina, che porta alla mancata espressione, analizzata mediante Western blotting, di p95 nelle linee cellulari NBS.
Una singola mutazione di origine slava, 657del5, rende conto di oltre il 90% di tutti gli alleli mutati nella NBS, mentre nove distinte mutazioni sono state identificate in pazienti di gruppi etnici diversi.

Mutazioni patogenetiche del gene NBS1 identificate fino ad oggi.
(fare click sulla figura qui sotto per vederne una rappresentazione schematica)

^#Omozigote/^°Eterozigote composto
*la mutazione 900del25 è stata identificata in una seconda famiglia studiata da Raymonda Varon (comunicazione personale).
^Uno dei  pazienti, sebbene non formalmente testato per mutazioni nel gene NBS1, proviene dalla stessa famiglia di altri tre pazienti diagnosticati mediante analisi molecolare, e mostra segni clinici e citogenetici di NBS.

Gennery et al. (2004) e New et al. (2005) hanno descritto 7 pazienti di 3 diverse famiglie di origine pakistana con una nuova mutazione 1089C>A omozigote del gene NBS1.
Prima dell'identificazione della mutazione omozigote del gene NBS1, in tutti i pazienti era stato posto il sospetto diagnostico di anemia di Fanconi (FA). Ciò era dovuto al fatto che il loro fenotipo clinico e cellulare era sovrapponibile sia a quello della NBS che della FA; le loro colture cellulari mostravano sensibilità aumentata sia agli agenti inducenti un danno di tipo cross-linking al DNA che alle radiazioni ionizzanti.
Uno dei pazienti con diagnosi presunta di FA è stato sottoposto a Trapianto di Midollo Osseo (TMO), che rappresenta invece il primo esempio descritto di utilizzo di TMO nella NBS (vedere Gestione Clinica e Trattamento per maggiori dettagli).

Struttura e funzione della nibrina

La proteina nibrina possiede due domini funzionali N-terminali, un dominio forkhead-associated (24-102 aa) ed un dominio di tipo breast cancer carboxy-terminal (108-196 aa), e un dominio C-terminale legante hMre11 (665-693 aa). Nella porzione centrale della proteina si trovano diverse sequenze SQ (), che costituiscono potenziali siti di fosforilazione.

Fare click sulla figura qui sotto per vedere uno schema dei domini funzionali della nibrina.

La proteina Nbs1 è coinvolta nel mantenimento della stabilità del genoma, in particolare nella risposta cellulare alle rotture a doppia elica del DNA (DSB). Le DSB rappresentano lesioni pericolose per la sopravvivenza della cellula e l'integrità del genoma, e possono essere prodotte sia da agenti esogeni (in particolare dalle radiazioni ionizzanti) che nel corso di processi fisiologici (es. ricombinazione dei geni delle immunoglobuline (Ig) e dei recettori delle cellule T (TCR)). La risposta cellulare alle DSB prevede l'azione concertata di sensori del danno, trasduttori del segnale ed effettori del riparo. La proteina ATM (ataxia-telangiectasia mutated) occupa un ruolo chiave in questa risposta, fosforilando diversi substrati a valle, compresi l'istone H2AX e Nbs1.
Nbs1 viene reclutata presso le DSB dalla interazione diretta dei suoi domini FHA/BRCT con l'istone H2AX fosforilato (γ-H2AX). Attraverso l'interazione con il dominio C-terminale  legante hMre11 della nibrina, due altre proteine, hMre11 e hRad50, vengono richiamate dal citoplasma al nucleo ai siti delle DSB e il complesso multimerico Nbs1/hMre11/hRad50 (N/M/R) forma foci ai siti di danno del DNA. Il complesso lega il DNA, ha attività nucleasica, è essenziale per la normale sensibilità alle radiazioni e sembra avere un ruolo nel processamento e nel riparo delle lesioni.
Almeno due diverse sequenze SQ della nibrina, in particolare i residui di serina 278 e 343, vengono fosforilate da ATM in risposta alla formazione di DSB. Nbs1 agisce nella cascata di attivazione ATM-dipendente dei checkpoint del ciclo cellulare, forse come modificatore/adattatore del segnale in pathway multipli. Il checkpoint di fase S è mediato da due vie parallele, una delle quali coinvolge ATM, NBS1 e SMC1. Nbs1 sembra anche modulare la fosforilazione da parte di ATM di altri substrati, quali p53 e Chk2, nel controllo delle transizioni di fase G1/S e G2/M.
Nelle cellule NBS con mutazioni troncanti bialleliche non si osserva la formazione dei foci di N/M/R e il difettoso riparo delle DSB del DNA può risultare nella genesi di anomalie cromosomiche, quali traslocazioni ed inversioni. Nello stesso tempo le disfunzioni nel controllo dei checkpoint del ciclo cellulare favoriscono un riparo error-prone, la duplicazione del DNA danneggiato e, di conseguenza, l'instabilità genomica.

Fare click sulla figura qui sotto per vedere uno schema della risposta al danno del DNA che coinvolge Nbs1.
(fare click qui prima di visualizzare l'immagine per avere anche una didascalia)

Forme varianti della nibrina nelle linee cellulari NBS

Sebbene nelle cellule NBS con mutazioni troncanti bialleliche non sia dimostrabile, mediante Western blotting, la sintesi della proteina p95, è possibile osservare nelle linee linfoblastoidi di pazienti NBS con mutazioni diverse la debole espressione di segmenti N-terminali e C-terminali di Nbs1. In particolare, segmenti C-terminali di più basso peso molecolare di p95, che conservano la capacità di interagire con hMre11, sono identificabili mediante test di co-immunoprecipitazione.
Una catena proteica C-terminale di circa 70 kDa viene prodotta con un meccanismo di inizio interno della traduzione dall'allele 657del5 e lo stesso meccanismo può essere ipotizzato anche per gli alleli 835del4 e 900del 25 che codificano per una proteina di 60 kDa e 55 kDa rispettivamente.

Recentemente la mutazione missenso R215W (643C>T) è stata trovata allo stato eterozigote composto (con la mutazione classica 657del5) in due gemelli monozigoti (Seemanova et al., 2006). I pazienti presentavano una forma severa di NBS con anomalie neurologiche e senza instabilità cromosomica, e gli Autori propongono che l'eterozigosità composta, 657del5/643C>T(R215W), sia la causa primaria del fenotipo clinico.
Nelle linee cellulari linfoblastoidi dei pazienti, si dimostrava la presenza di nibrina di normale peso molecolare, ma con ridotta espressione quando comparata con i controlli e con eterozigoti per le mutazioni 657del5 o 643C>T, in quanto la nibrin-Trp215 era molto meno abbondante della nibrina-Arg215 wildtype. Gli Autori suggeriscono che questa differenza possa indicare un ridotto livello di espressione dell'allele 643C>T(R215W), un tempo di emivita più breve dell'mRNA o, più probabilmente, una ridotta stabilità della nibrina-Trp215. Ciò potrebbe a sua volta riflettere un'incapacità della proteina mutante di associarsi correttamente con Mre11 e Rad50, e la successiva degradazione del monomero di nibrina non-legata. Nelle cellule che possiedono solo una nibrina troncata come alternativa (657del5 in questi pazienti), la mutazione 643C>T potrebbe perciò portare a una riduzione del complesso trimerico attivo sotto un livello critico. La mutazione missenso di NBS1 potrebbe anche interferire con la residua attività della proteina troncata prodotta dall'allele 657del5 con meccanismo dominante negativo, producendo così un effetto aggiuntivo sul fenotipo rispetto a quanto atteso come conseguenza dell'assenza o riduzione della proteina, come accade normalmente con le mutazioni troncanti (vedi anche Fenotipo Clinico e Citogenetica e Fenotipo Cellulare).

Pagina aggiornata il: 18 maggio 2007